Исследователи Института Солка создали атлас микропротеинов человеческого мозга, который может помочь в изучении старения и нейродегенеративных заболеваний. Проанализировав более 600 образцов посмертной ткани лобной коры, ученые выявили 1067 микропротеинов, отсутствующих в основной проверенной базе белков. Один из них оказался связан с энергетическим обменом в микроглии — иммунных клетках мозга, участвующих в развитии болезни Альцгеймера. О том, что такое микропротеины и почему ученые десятилетиями не замечали их, — в материале «Известий».
Что такое микропротеины
Практически каждая клетка человеческого организма содержит один и тот же генетический код. Однако разные клетки используют различные его участки для производства белков, которые определяют их функции и особенности. Именно поэтому нейрон отличается от клетки сердца, а иммунная клетка — от мышечной.
Справка «Известий»Белки состоят из цепочек аминокислот. Многие хорошо изученные белки включают сотни или тысячи таких элементов. Микропротеинами обычно называют значительно более короткие молекулы — в новом исследовании к ним относили белки длиной не более 150 аминокислот.
Долгое время считалось, что небольшие участки генома, способные кодировать такие молекулы, не производят функциональных белков. Они могли восприниматься как часть некодирующей ДНК или вспомогательные элементы, регулирующие синтез более крупных белков. По мере совершенствования методов анализа выяснилось, что многие из этих участков действительно считываются клетками и могут создавать самостоятельные продукты.
Однако обнаруживать микропротеины значительно сложнее, чем крупные белки. Во время стандартного протеомного анализа белки расщепляют на фрагменты — пептиды, которые затем регистрирует масс-спектрометр. Для надежного подтверждения существования белка обычно требуется найти как минимум два характерных для него пептида. У короткой молекулы таких подходящих фрагментов может просто не быть.
В результате многие микропротеины могли десятилетиями оставаться за пределами научных баз данных, даже если клетки активно их производили.
«Мы всё еще не до конца понимаем молекулярные механизмы здорового старения. Особенно это касается микропротеинов, которые десятилетиями непреднамеренно оставались без внимания», — рассказал старший автор исследования, профессор Института Солка Алан Сагателян.
По его словам, новый атлас позволит систематически изучать микропротеины при старении и нейродегенерации, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона.
Как ученые составляли атлас
Исследователи объединили данные транскриптомики, рибосомного профилирования и масс-спектрометрии. Первый метод позволяет определить, какие участки генома считываются в клетках, второй — какие последовательности используются для синтеза белков, а третий подтверждает физическое присутствие белковых фрагментов в ткани.
Основой работы стали образцы дорсолатеральной префронтальной коры — области лобной доли мозга, связанной с памятью, планированием, вниманием и принятием решений. В исследование вошли материалы нескольких посмертных коллекций человеческого мозга. Через протеогеномный конвейер прошли 610 образцов, 608 из них соответствовали критериям качества. Для сравнительного анализа содержания микропротеинов ученые отобрали 480 образцов из проекта Religious Orders Study and Memory and Aging Project.
Среди них 111 принадлежали людям без болезни Альцгеймера, 182 — людям с характерными патологическими изменениями мозга, но без прижизненных симптомов деменции, еще 187 — пациентам с патологическими изменениями и клиническими проявлениями заболевания. Средний возраст доноров в этой части исследования составлял около 88 лет.
Ученые повторно обработали уже существующие данные при помощи собственных компьютерных программ. В частности, они применили созданный лабораторией Сагателяна инструмент машинного обучения ShortStop. Он анализирует небольшие открытые рамки считывания — участки генетического кода, потенциально способные производить микропротеины.
Алгоритм учитывает последовательность аминокислот и физико-химические свойства предполагаемых молекул. Его обучили отличать известные короткие белки от искусственно созданных последовательностей с похожими характеристиками.
Одних расчетов было недостаточно. Чтобы подтвердить существование найденных молекул, ученые сопоставили прогнозы с результатами масс-спектрометрии. Фактически исследователи сравнивали экспериментально зарегистрированные белковые фрагменты с тем, как должен был выглядеть их спектр согласно компьютерной модели. Такой комплексный подход помог снизить вероятность того, что за микропротеин будет принят случайный сигнал.
Сколько микропротеинов обнаружили
В общей сложности ученые проанализировали 3001 микропротеин, отсутствующий в рецензируемом разделе базы UniProtKB. Для 1067 молекул были получены спектральные данные высокого уровня достоверности. Еще 1433 микропротеина получили среднюю оценку достоверности и потребуют дополнительной проверки.
Многие из 1067 наиболее надежно подтвержденных микропротеинов ранее не обнаруживали в ткани человеческого мозга. При этом исследователи не утверждают, что все найденные молекулы обязательно выполняют самостоятельные биологические функции. Атлас прежде всего подтверждает их присутствие и предоставляет основу для последующих экспериментов.
Сложность заключалась в том, что 814 из 1067 микропротеинов удалось подтвердить только по одному уникальному пептиду. При использовании стандартного правила, требующего обнаружения двух пептидов, большинство этих молекул осталось бы незамеченным. Поэтому авторы дополнительно проверяли, считываются ли соответствующие участки генома рибосомами, и оценивали совпадение зарегистрированных и спрогнозированных спектров.
Почти три четверти обнаруженных микропротеинов кодировались участками генома, которые уже считались ответственными за производство более крупных белков. Это означает, что один и тот же генетический участок может создавать несколько разных продуктов, часть которых не учитывалась в традиционных моделях.
В ряде случаев количество микропротеина менялось независимо от содержания основного белка, закодированного тем же геном. Следовательно, анализ только на уровне генов или крупных белков может не показывать всех молекулярных изменений, происходящих при нейродегенеративном заболевании.
Как микропротеины отличались при болезни Альцгеймера
Авторы сравнили образцы людей без заболевания и пациентов с симптоматической болезнью Альцгеймера. В наиболее строгой модели, где микропротеин должен был обнаруживаться не менее чем в половине образцов, ученые выявили 22 ранее не включенные в проверенную базу молекулы, содержание которых статистически значимо различалось между группами.
При расширении критериев число потенциально связанных с заболеванием микропротеинов увеличивалось. Менее строгий поисковый анализ позволил выделить до 258 кандидатов. Однако такие результаты требуют дополнительного подтверждения, поскольку при работе с тысячами коротких молекул возрастает риск случайных совпадений.
Исследователи также обнаружили 99 уже известных коротких белков, содержание которых различалось между тканями мозга людей с болезнью Альцгеймера и без нее. Некоторые изменения совпали с результатами предыдущих исследований, что стало дополнительной проверкой точности разработанной системы.
При этом различия не всегда были крупными. Авторы подчеркнули, что посмертная ткань мозга состоит из множества типов клеток, поэтому изменения, характерные только для определенной клеточной популяции, могут быть менее заметны при анализе общего образца.
Особое внимание ученые уделили микроглии — иммунным клеткам центральной нервной системы. Они следят за состоянием ткани мозга, удаляют поврежденные клетки и участвуют в воспалительной реакции. С возрастом и при нейродегенеративных заболеваниях функции микроглии могут нарушаться.
Что ученые обнаружили в микроглии
Среди потенциально важных молекул исследователи выделили микропротеин длиной в 63 аминокислоты, получивший название micro-MKKS63. Он кодируется короткой рамкой считывания в гене MKKS.
Ранее этот участок генома был известен главным образом благодаря более крупному белку длиной в 570 аминокислот. Однако в образцах лобной коры исследователи почти не нашли признаков производства крупного белка. Micro-MKKS63, напротив, оказался преобладающим белковым продуктом этого генетического участка.
У пациентов с симптоматической болезнью Альцгеймера содержание micro-MKKS63 было ниже, чем у людей без заболевания. При этом уровень транскриптов, кодирующих крупный белок MKKS, существенно не менялся. Это подтвердило, что микропротеин может регулироваться отдельно от основного продукта того же гена.
Дополнительный анализ показал, что micro-MKKS63 связан с работой митохондрий — внутриклеточных структур, обеспечивающих производство энергии. Исследователи обнаружили микропротеин в митохондриальной области человеческих клеток микроглии.
Затем при помощи системы редактирования генома CRISPR–Cas9 ученые нарушили только короткую рамку считывания, отвечающую за micro-MKKS63, сохранив при этом участок, кодирующий крупный белок MKKS.
После удаления микропротеина в двух независимо созданных линиях клеток снизились базовое потребление кислорода, максимальная интенсивность дыхания и производство энергии, связанное с АТФ. Полученные данные указывают на то, что micro-MKKS63 необходим для нормального окислительного фосфорилирования — одного из основных механизмов выработки энергии в клетке.
Таким образом, уменьшение содержания micro-MKKS63 может быть связано с энергетическими нарушениями в микроглии при болезни Альцгеймера. Однако пока неизвестно, способствует ли нехватка микропротеина развитию заболевания или становится следствием уже происходящих патологических процессов.
Почему открытие важно для исследования генома
Работа показывает, что современная карта человеческого протеома остается неполной. Ученые хорошо изучили многие гены и крупные белки, однако это не означает, что известны все молекулы, которые клетки способны производить.
«Иногда предполагается, что мы знаем всё о нашем геноме и обо всех белках, которые могут создавать наши клетки. Это просто неправда», — подчеркнул Сагателян.
Обнаружение micro-MKKS63 также демонстрирует, что традиционно выделяемый «основной» белок гена необязательно является его главным продуктом во всех тканях. В клетках мозга более короткая и ранее малоизученная молекула может производиться значительно активнее крупного белка, который уже внесен в справочники.
Это важно для поиска биомаркеров и терапевтических мишеней. Если ученые изучают только канонический белок, они могут не заметить другой продукт того же гена, который сильнее связан с работой определенного типа клеток или заболеванием.
Атлас позволяет исследователям проверить, какие микропротеины присутствуют в клетках мозга, как меняется их содержание при старении и нейродегенерации и какие молекулы заслуживают отдельного функционального изучения. Авторы сделали доступными данные об экспрессии, оценки достоверности спектров и программы обработки информации.